一、ZFNs動物模型技術原理與核心機制

ZFNs 是第一代可編程基因編輯工具，通過融合 DNA 結合域（鋅指蛋白）與 DNA 切割域（FokI 核酸酶）實現靶向編輯：

1. 鋅指蛋白結構域：

• 由 30-34 個氨基酸重復單元構成，每個單元通過 第 12、13 位可變殘基（RVDs） 識別特定堿基：

• 單個鋅指識別 3 bp，串聯 3-6 個可靶向 9-18 bp 序列。

2. FokI 切割域：

• 需 二聚化 才能激活切割功能 → ZFNs 需成對設計（左臂/右臂），切割位點位于兩臂結合位點之間（間隔區 5-7 bp）。

3. 編輯機制：

• 雙鏈斷裂（DSB）→ 細胞啟動修復路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：隨機插入/缺失（Indels），導致基因敲除。

• 同源定向修復（HDR） ：需外源修復模板（如 ssODN），實現點突變或基因插入。

技術突破：shou次實現哺乳動物基因組靶向編輯（2005 年），開啟精準基因編輯時代 。

二、ZFNs動物模型流程與技術優化

（一）標準化操作步驟

（二）關鍵技術參數優化

• 3-6 個鋅指單元串聯

• Golden Gate 克隆（BsaI/BsmBI） | 6 天完成構建，成功率 >80%  |
  | 表達載體 | 雙啟動子載體（CMV/T7），支持 mRNA 合成與蛋白表達 | 適配多物種（斑馬魚、小鼠、豬）  |
  | 遞送方式 | - 受精卵顯微注射 ZFNs mRNA

• 體細胞轉染 + 核移植（大型動物） | mRNA 遞送減少脫靶  |
  | 修復增強 | 聯合 ssODN 模板 + NHEJ 抑制劑（SCR7） | HDR 效率提升 3 倍  |

三、多物種應用案例與模型優勢

（一）典型物種與疾病模型

（二）不可替代性應用場景

1. 高 GC 區域編輯：

• 無 PAM 序列限制，可靶向 CRISPR/Cas9 無法編輯的區域 。

2. 低脫靶率需求：

• 治療性編輯中脫靶率<0.1%（CRISPR 為 1-10%）。

3. 大型動物模型：

• 豬、牛等物種中免疫原性低于 CRISPR 。